Avanços na dosagem hormonal em cães (Substituição dos radioimunoensaios)
O entendimento da regulação hormonal e a busca por diagnósticos mais sensíveis e específicos de desordens endócrinas levaram ao desenvolvimento de métodos de análise cada vez mais precisos. Antes da década de 60, substâncias contidas no sangue ou em outros fluidos, que apresentavam concentrações muito baixas, eram quase impossíveis de serem dosadas. Até então, quimio e bioensaios não específicos eram realizados, obtendo-se respostas com pouca precisão.
A técnica utilizando um anticorpo como ligante (imunoensaio) foi descrita pela primeira vez em 1960 utilizando isótopos radioativos de Iodo e Trítio como marcadores. A partir deste evento, surgiram várias técnicas de dosagem de hormônios e substâncias presentes em quantidades mínimas nos fluidos corpóreos como drogas, enzimas e hormônios. O radioimunoensaio foi o mais utilizado e foi substituído gradativamente por outros métodos imunológicos, como os ensaios fluorescentes (Fluoresceína, rodamina, európio), quimioluminescentes (luminol) e enzimáticos (fosfatase alcalina). Ambos diferem pelo tipo de anticorpo utilizado e pela forma como é feita a leitura dos complexos formados.
O princípio do método do imunoensaio baseia-se em uma reação imunológica in vitro entre antígeno e anticorpo. Praticamente todas as técnicas de imunoensaio utilizam o mesmo princípio básico, onde a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não marcado na amostra. Dependendo da maior ou menor quantidade presente de hormônio, haverá maior disponibilidade de sítios de ligação do anticorpo para se ligar ao antígeno (hormônio), dependendo da maior ou menor quantia do hormônio a ser determinado.
No caso dos radioimunoensaios, marcadores radioativos ajudam a determinar a concentração de antígenos com uma precisão bastante elevada, sendo bastante usada para a determinação da concentração de hormônios. Existem desvantagens no uso de radioisótopos como marcadores em imunoensaios, tais como, meia vida limitada, instabilidade dos componentes radiomarcados, equipamento de análise relativamente caro, necessidade de mão de obra qualificada e bem treinada, laboratórios especializados e lixo radioativo.
A quimioluminescência é um tipo de reação química, que ao se processar gera energia luminosa. Durante uma reação química, os reagentes se transformam em esta dos intermediários eletronicamente excitados, e ao passarem para um estado de menos excitado, liberam a energia absorvida na forma de luz.
Imunoensaios com fluorescência são, em geral, baseados na transferência de energia de excitação do antígeno marcado para o anticorpo também marcado. Os compostos fluorescentes possuem elétrons que podem ser excitados para um estado mais elevado pela absorção de luz de determinado comprimento de onda, emitindo luz com comprimento de onda maior que a absorvida. Este processo só ocorre em partículas ligadas ao antígeno. Fluoresceína e rodamina são os mais comumente utilizados, respectivamente, como marcadores doadores e aceptores. O intervalo de tempo entre absorção e emissão para o composto fluoresceína é menor que 1 nanosegundo. Os espectros de excitação e emissão sobrepõe-se e eles são particularmente susceptíveis a perda de detecção causada por dispersão de fundo de luz.
Considerando as propriedades ópticas do Európio, elemento químico que faz parte dos lantanídeos na Tabela Periódica, ele é utilizado como marcador de proteínas e aminoácidos. Em sua forma de íon, apresenta grande número de níveis de energia e proporciona emissões desde o infravermelho até o ultravioleta. A substância possui faixas distintas de excitação (340nm) e emissão (590-613nm), sem sobreposição das curvas, gerando um resultado mais preciso quando é utilizado como molécula imunofluorescente. Outra característica importante do Európio é a sua life time de aproximadamente 0,5 milissegundos, que é de 10 a 100 vezes maior do que a maioria dos fluoróforos. Desta forma, ele evita a interferência não específica nas leituras e proporciona resultados mais específicos.
As exigências das legislações nacionais e internacionais em questões ambientais têm aumentado nos últimos anos. Neste sentido, é necessário contínuo desenvolvimento e aperfeiçoamento de novas técnicas imunoanalíticas para investigação de amostras clínicas. As tendências atuais da utilização de imunoensaios tem como meta satisfazer necessidades analíticas, como a simplicidade, sensibilidade, uso de marcadores não radioativos, reprodutibilidade e estabilidade do sistema (sistemas reutilizáveis) e rapidez.
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REFERÊNCIAS:
BURTIS, C.; BRUNS, D., Tietz Fundamentos de química clínica e diagnóstico molecular, Tradução da 7ª edição, Elsevier, 2016.
GIL, E. D., KUBOTA, L. T., & YAMAMOTO, Y. I. Alguns aspectos de imunoensaios aplicados à química analítica. Química Nova, edição 22, Páginas 974-881; 1999.
